Медицина и здоровье

ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЦЕПТОРОВ ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ

Исследования по связыванию, проводимые с помощью меченных радиоактивными атомами гормонов, позволили выявить некоторые характерные особенности, свойственные рецепторам многих пеп­тидных гормонов. Универсальной чертой рецепторов является их способность распознавать и связывать соответствующие химические передатчики или гормоны в присутствии избытка молекул других видов. Это свойство легко проявляется в присутствии ме­ченого гормона как избирательная реакция связывания с высоким сродством, которая приводит к образованию специфического гормонрецепторпого комплекса. За последние несколько лет такие взаимодействия наблюдались во многих гормончувствительных тканях. Во многих исследованиях наличие специфических связы­вающих мест в соответствующих тканях-мишенях принимали за доказательство присутствия гормональных рецепторов. Специфи­ческие связывающие места обнаружены также в клетках, кото­рые не принято считать клетками-мишенями, например рецепто­ры инсулина и СТГ в лимфоцитах, рецепторы пролактина в пе­чени и надпочечниках. Если учитывать, что правильное представление о рецепторах предполагает присутствие не только распознающего, но и запускающего реакцию компонента, то под такое определение не подходят рецепторы, для которых функцио­нальная реакция пока остается не выясненной, а также рецепто­ры, которые выделены, солюбилизированы или расположены на нереагирующих клеточных компонентах. Таким образом, рецептор характеризуется специфическим связыванием лиганда и способ­ностью передавать регуляторный сигнал, если даже дистальные элементы реакции отсутствуют или неидентифицированы.

Наиболее полное представление о рецепторе пептидного гор­мона включает двоякие функциональные свойства: поверхностное распознавание и трансляцию гормонрецепторного взаимодействия в специфическую биологическую реакцию. Независимо от того, является ли клеточной реакцией секреция пептидов, стероидогенез, сокращение или транспорт ионов, механизмы, опосредующие гормональный эффект, обычно включают изменение кальциевых потоков и метаболизма циклических нуклеотидов. На мембранных фракциях или интактных клетках многих тканей-мишеней наблю­дали зависимость между связыванием гормона и биохимическими реакциями. Корреляция между насыщенностью рецепторов и ак­тивностью аденилатциклазы продемонстрирована на препаратах мембран многих гормончувствительных клеток, например клеток надпочечника в случае действия АКТГ, печени в случае действия глюкагона, почек при добавлении вазопрессина, эритроцитов птиц под влиянием катехоламинов, семенных канальцев в присутствии ФСГ, а также семенников и яичников в присутствии ЛГ и ХГЧ. В интактных тканях и изолированных клетках-мишенях связы­вание гормона также коррелировало с синтезом и высвобождени­ем цАМФ [6]. Корреляцию связывания гормона с последующими клеточными реакциями наблюдали в отношении инсулина и окис­ления глюкозы в жировых клетках или транспорта аминокислот в тимоцитах, катехоламинов и транспорта натрия в эритроцитах,. ЛГ и продукции андрогенов семенниками, а также ангиотензи­на II и продукции альдостерона клетками клубочковой зоны над­почечника.

Иногда полагают, что гормональными рецепторами следует называть только те связывающие места ткани, которые можно отождествить с определенной биохимической реакцией. Однако» специфическое связывание меченых лигандов при условии соблю­дения адекватных требований к методике его определения все-же является веским указанием на присутствие гормональных ре­цепторов. К таким требованиям относятся использование мече­ного гормона с отчетливой биологической активностью (получен­ного с помощью монойодирования или тритирования), точная оценка неспецифического связывания и исключение связывания с разрушающими или другими ферментативными активностями, присутствующими в тканевых фракциях. Большинство рецепторов пептидных гормонов проявляет высокую специфичность по отно­шению к биологически активным гормонам или их производным,, высокое сродство связывания, характеризующееся константами; равновесия ассоциации порядка 10⁹—10¹¹ М~¹, и насыщаемость при относительно низких концентрациях гормона. Последние свой­ства соответствуют низкой концентрации гормональных рецепто­ров в ткани-мишени, которая составляет обычно всего несколько» тысяч мест на клетку. Реакция связывания всегда зависит от тем­пературы, отличается высокой скоростью и в бесклеточных пре­паратах обычно обратима. В интактных клетках недавно был об­наружен необратимый компонент связывания гормона, и для тромбина и фактора роста эпидермиса (ФРЭ) было показано ко­валентное присоединение лиганда к рецептору. Точное опре­деление констант связывания и термодинамических свойств ре­цепторов часто затрудняется тем, что в опытах по связыванию, проводимых in vitro при физиологических температурах, может иметь место деградация гормона и рецептора. В условиях же, свойственных экспериментам in vivo, также трудно изучать ки­нетические и связывающие свойства рецепторов гормонов. На скорость ассоциации и диссоциации гормона большое влияние оказывает температура, а кругооборот молекул гормона в местах рецепции при характерных для организма условиях температуры и перфузии изучен недостаточно.

Белковая природа рецепторов полипептидных гормонов на плазматической мембране доказывается их расщеплением под действием различных протеолитических ферментов и пептидаз. На многие рецепторы влияет также фосфолипаза, что указывает на содержание в них важного фосфолипидного компонента или на роль ассоциации с фосфолипидной структурой мембраны в проявлении связывающей активности. Сообщалось, что некото­рые рецепторы (для инсулина, ЛГ и ТТГ) содержат углеводные компоненты, иногда влияющие на связывающую активность. От­дельные рецепторы, такие, как рецепторы ЛГ, ФСГ и пролактина, для сохранения своей биологически активной конформации тре­буют присутствия дисульфидных групп.

Физико-химическая характеристика рецепторов пептидных гор­монов затрудняется в результате их относительной нераствори­мости, что свойственно многим белкам, содержащимся в мембра­не. В нескольких тканях из клеток и клеточных частиц удалось выделить рецепторы с помощью ограниченного ферментативного расщепления или инкубации в условиях, способствующих высво­бождению поверхностных белков. Однако растворимые гормональ­ные рецепторы для физико-химического анализа получают обыч­но путем экстрагирования из мембранных фракций и гомогенатов с помощью неионных детергентов, таких, как тритон Х-100 и люброл. Растворение плазматических мембран детергентами обыч­но приводит к утрате функционального сопряжения между гормонсвязывающими местами и ассоциированными с мембраной ак­тивностями, такими, как аденилатциклаза. Однако после удаления детергента наблюдается частичное восстановление гормонстимулируемой активности аденилатциклазы, а иногда после экстраги­рования из тканевых фракций неионными детергентами солюбилизированная аденилатциклаза сохраняет чувствительность к гор­мону. В настоящее время из клеточных мембран экстрагированы специфические места связывания ацетилхолина, ангиотензина II, инсулина, глюкагона, ЛГ — ХГЧ, ФСГ, пролактина и» гормона роста [8].

Переформированные гормонрецепторные комплексы, образуе­мые путем насыщения тканей-мишеней меченым гормоном, мож­но легко экстрагировать с помощью обработки неионными детергентами. Такие гормонрецепторные комплексы обычно более ста­бильны в растворе, чем свободные, или «ненагруженные» рецепторы, и создают некоторые преимущества для физической характеристики. Яичниковые рецепторы ЛГ, предварительно ме­ченные in vivo путем инъекции радиоактивного гонадотропина, обладают теми же самыми физическими свойствами, что и гор­монрецепторные комплексы, образуемые путем метки нераство­римых фракций in vitro до солюбилизации. Некоторые свободные рецепторы и гормонрецепторные комплексы анализировали с по­мощью гельфильтрации и центрифугирования в градиенте плот­ности, и их молекулярная масса колебалась от 150 000 до 400 000.

Большинство солюбилизированных детергентом рецепторов при физическом анализе обнаруживают свойства молекул удлиненной формы с относительно большими для их констант седиментации (6,5—9,08) гидродинамическими радиусами в 6—7 нм. Эти свой­ства во многом обусловлены гликопротеиновой природой и выра­женной асимметрией рецепторной молекулы, но отчасти могли бы объясняться и связыванием детергента с солюбилизированным белком. Очистку солюбилизированных детергентом гормональных рецепторов производили с помощью соответствующих методик фракционирования, а также аффинной хроматографии на гель-лигандных комплексах. Обычно такая очистка ограничена; глав­ное исключение составляет холинергический рецепторный белок из ткани электрических органов некоторых рыб. С помощью аффинной хроматографии очищали также изолированные рецепторы инсулина, ЛГ — ХГЧ и пролактина. Хотя выход был весьма небольшим, но очищенные рецепторы оказались относительно ста­бильными и сохраняли высокое сродство и специфичность связы­вания гормональных лигандов. Этим методом тестикулярные ре­цепторы ЛГ были очищены примерно в 15000 раз, т. е. до 50% гомогенности белка. Наиболее высоко очищенный препарат ре­цептора ЛГ мигрирует при SDS-гель-электрофорезе в виде одного-компонента с молекулярной массой около 90 000, что свидетель­ствует о том, что экстрагированный детергентом рецептор пред­ставляет собой димер, состоящий из двух близких субъединиц [6]. Рецепторы пролактина и СТГ из ткани молочной железы и печени также были очищены с помощью аффинной хроматогра­фии, причем было показано, что антитела, полученные к очи­щенным рецепторам пролактина, ингибируют биологическое дей­ствие этого гормона на его ткани-мишени [9]. Для анализа струк­турных особенностей, определяющих связывание гормона и активацию ассоциированных с мембраной ферментных систем, которые опосредуют его действие, необходима очистка больших количеств рецепторных мест.

Рис. 4—3. «Плавающий рецептор»—двухстепенная физическая модель взаи­модействия пептидного гормона с рецептором и активации аденилатцикла­зы в клеточной мембране.

<< Prev - Next >>