РАДИОРЕЦЕПТОРНЫЙ АНАЛИЗ
Принцип радиорецепторного метода по существу не отличается от радиоиммунологического, только гормон, вместо того чтобы связываться с антителами, связывается со специфическим гормональным рецептором плазматической мембраны или цитозоля. Специфические рецепторы большинства полипептидных гормонов располагаются на наружной поверхности плазматической мембраны клеток, тогда как рецепторы биологически активных стероидов, а также тироксина и трийодтиронина — в цитозоле и ядрах [43, 44]. Чувствительность радиорецепторного анализа ниже, чем радиоиммунологического и большинства биологических методов в системах in vitro. Для того чтобы взаимодействовать со своим рецептором, гормон должен иметь соответствующую конформацию, т. е. быть биологически активным. Возможна ситуация, в которой гормон теряет способность связываться со своим рецептором, но продолжает взаимодействовать с антителами в системе для радиоиммунологического анализа. Это расхождение отражает тот факт, что антитела и рецепторы «узнают» разные участки молекулы гормона.
Предложен ряд радиорецепторных методов гормонального анализа. Обычно получают ткань специфического для данного гормона органа-мишени и с помощью стандартных методик выделяют из нее рецепторы. Изолированные рецепторы плазматической мембраны в осадке при хранении в условиях температуры менее —20 °С относительно стабильны. Однако солюбилизированные рецепторы полипептидных и стероидных гормонов, выделенные из плазматических мембран либо из цитозоля и не связанные с лигандами, оказываются нестабильными, что проявляется снижением их способности связывать специфические гормоны, даже если они хранились в замороженном виде, сравнительно недолго.
Йодирование полипептидных гормонов должно осуществляться с помощью методов, изменяющих их биологическую активность лишь в минимальной степени. Для сохранения биологической активности на каждую молекулу гормона должен приходиться один атом йода. Чрезмерное йодированно обычно значительно изменяет биологическую и иммунологическую активность гормона. Кроме того, некоторые реактивы, используемые в процессе йодирования, являются сильными окислителями или восстановителями, и поэтому их концентрация должна быть сведена к минимуму. Применяющиеся в настоящее время методы йодирования описаны ранее.
Рис. 5—5. Скетчардовский график данных, получаемых при радиорецепторном исследовании.
Обозначения см. на рис. 5-1.
ХАРАКТЕРИСТИКА ГОРМОНРЕЦЕПТОРНОГО СВЯЗЫВАНИЯ
Для характеристики взаимодействия гормона с рецептором или антителом предложены различные методы математического анализа. При взаимодействии гормона [Г] с его специфическим рецеп--тором [Р] простая обратимая реакция между двумя молекулами в условиях равновесия может быть охарактеризована как
где [ГР] — гормонрецепторный комплекс. Предполагается, что как гормон, так и рецептор гомогенны и имеют один специфически связывающий участок. Взаимодействие гормона и рецептора далее можно описать следующим образом
где Ка—равновесная константа ассоциации (л/моль или М~1), ka — константа скорости ассоциации, ka— константа скорости диссоциации, Kd — константа диссоциации (моль/л, или М).
Зависимость между общей концентрацией рецепторов и концентрацией занятых рецепторов может быть изображена следующим образом
где [Ро] — общая концентрация рецепторов, [ГР]— концентрация связанных с гормоном рецепторов, а [Р] — концентрация свободных рецепторов.
Преобразуя приведенные выражения, можно получить уравнения (5—4а) и (5—46), которые при графическом написании дают обычно прямолинейную зависимость с наклоном, равным — 1/Кa, или — Ка
Уравнения (5—4а) и (5—46) являются математическим написанием графика Скетчарда, в виде которого данные о гормонрецепторном взаимодействии представляются, вероятно, наиболее часто [45, 46]. Эти уравнения применяются также для характеристики взаимодействия гормона с антителами. График Скетчарда представлен на рис. 5—5. Точка пересечения кривой с осью абсцисс представляет собой [Ро), а с осью ординат Ка[Ро],или (1/Kd) [Ро]. Наклон линии равен — Ка, или —1/Kd. Следовательно при графическом изображении данных по отрезкам осей координат можно непосредственно определить [Ро] и [ГР]/[Г]. Для расчета Ка используют следующие рассуждения. Поскольку член —Ка[ГР] из уравнения (5—46) при нулевом количестве связанного гормона [ГР] становится равным нулю, то
где В — концентрация связанного гормона, а F — концентрация свободного гормона, или
Зная молярную концентрацию рецептора, можно определить число связывающих участков на клетку или на массу белка, умножив количество молей рецептора на 6,02•1023 (число Авогадро, или число молекул в моле).
Константы ассоциации, полученные в разных радиорецепторных исследованиях, обычно колеблются между 10–11 и 10–9M–1. Однако не все графики Скетчарда линейны. Их нелинейность отражает аллостерическое межрецепторное взаимодействие, приводящее к повышению (положительная кооперативность) или снижению (отрицательная кооперативность) связывания гормона после начального взаимодействия его с рецепторами. Данные,. полученные в исследованиях по рецепторному связыванию гормона, можно преобразовывать дальше, и с помощью графика Хилла выяснить, действительно ли в системе происходят аллостерические взаимодействия [47, 48]. Если наклон прямой на графике Хилла значительно отличается от единицы, то они существуют. При получении нелинейного графика Скетчарда следует учитывать не только аллостерические взаимодействия, но и другие факторы. К ним относятся артефакты, обусловливаемые проведением анализов в неравновесных условиях, неточной оценкой неспецифического связывания, ошибками в разделении свободного и связанного гормона и значительными различиями сродства к рецептору меченого и немеченого гормона [49].
ГОРМОНАЛЬНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ СОСТОЯНИЯ
Описан ряд клинических состояний, при которых нарушается взаимодействие между гормоном и его специфическим рецептором. Такие нарушения объясняют изменением числа рецепторов или их сродства к гормону, а также спонтанным образованием антител к гормональным рецепторам. У больных с атаксией -телеангиэктазией может отмечаться резкая инсулинорезистентность вследствие выраженного уменьшения сродства рецепторов к инсулину [50]. У некоторых больных со злокачественной миастенией образуются антитела к экзогенным рецепторам ацетилхолина, что и обусловливает развитие соответствующего клинического синдрома [51]. Подобно этому у больных с acanthosis nigricans клинически выявляется инсулинорезистентность, причем результаты обследования таких больных убедительно свидетельствуют о роли антител к инсулиновым рецепторам в имеющейся инсулинорезистентности [52]. Число специфических рецепторов инсулина, приходящееся на каждую клетку, может быть снижено при ожирении, вследствие чего у тучных больных уменьшается чувствительность к инсулину. При уменьшении массы тела у этих больных число инсулиновых рецепторов на клетку увеличивается и нормализуется чувствительность к инсулину [53]. У некоторых больных с гипертиреозом в крови присутствуют антитела к рецепторам ТТГ. В отличие от больных со злокачественной миастенией и диабетом, у таких больных антитела к рецепторам ТТГ могут стимулировать мембранные рецепторы в ткани щитовидной железы, индуцируя повышенную продукцию и секрецию тироксина и трийодтиронина, что и обусловливает гипертиреоидное состояние [54].
В отдельных случаях концентрация рецепторов стероидных половых гормонов может определять успех определенных видов терапии [55, 56]. Так, вмешательства в деятельность эндокринной системы оказывают благоприятный эффект у женщин, больных раком молочной железы в пременопаузе, у которых раковая ткань содержит рецепторы эстрогенов. Такие вмешательства приносят успех у 50—70% женщин, у которых выявляется значительная концентрация рецепторов эстрогенов в опухоли, и менее чем у 10% больных, раковая ткань у которых не содержит соответствующих рецепторов. В качестве эндокринотерапии применяется обычно хирургическое удаление яичников, надпочечников и гипофиза. Предложены различные антиэстрогенные лекарственные вещества, к которым относятся нафоксидин, тамоксифен и кломифен. Больные в пременопаузе, леченные сочетанием воздействий на эндокринную систему, выживают в течение гораздо более длительного срока, чем лица, не получающие соответствующего лечения.