ЛИГАНДНЫЙ АНАЛИЗ
РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Радиоиммунологические методы в настоящее время, вероятно, наиболее широко применяются для количественного определения гормонов и многих других соединений в биологических жидкостях. Как показывает само название, радиоиммунологический метод представляет собой иммунологическое исследование, в котором используют меченые гормоны или связывающие их антитела. Более 20 лет назад Berson и Yalow [26] предложили радиоиммунологический метод определения инсулина. Этот метод основывался на их наблюдении, согласно которому в периферической крови больных диабетом, получавших инсулин, присутствует белок (который, как было показано позднее, является глобулином), связывающий инсулин, меченный 131I Значение этих данных и последующей разработки радиоиммунологического метода определения инсулина подчеркивается присуждением Yalow и Berson нобелевской премии. Вскоре после первых сообщений этих исследователей другими лабораториями были разработаны и описаны соответствующие методы для определения других гормонов. В этих методах применяются либо антитела, либо сывороточные белки, связывающие определенный гормон или лиганд и несущий радиоактивную метку-гормон, конкурирующий со стандартным гормоном или гормоном, присутствующим в биологической пробе.
Термодинамически взаимодействие антигена и антитела можно рассматривать как реакцию псевдопервого порядка, которая схематически может быть представлена следующим образом
где Аг — антиген или гормон, at — антитело к антигену или гормону, Аг — радиоактивно меченный антиген или гормон. Kd — константа скорости диссоциации. Ка — константа скорости ассоциации.
Рис. 5—1. Кривые доза—реакция, полученные с помощью трех разных методов определения гормонов. а—преобразования данных в системе logit-координат, где N—импульсы, обусловленные неспецифическим связыванием, Во — максимальное число импульсов связанного гормона, когда в инкубационной среде присутствуют только антитела и меченый гормон; б — данные представлены как отношение импульсов связанного гормона (В) к импульсам (F) против логарифма концентрации гормона; в — кривая доза — реакция для определения стероидного гормона в координатах В/Т против дозы гормона, где Т — общее число импульсов.
Реакция антиген—антитело обратима, но скорость диссоциации комплекса антиген—антитело значительно меньше, чем скорость его ассоциации. Количество гормона, связанное с антителом, является результирующей скоростей ассоциации и диссоциации.
Поскольку в каждую пробирку вносят постоянную концентрацию антител и меченого гормона, количество импульсов, связанных с антителами, должно зависеть от концентрации немеченого гормона, добавляемого в виде стандарта или неизвестной пробы. Чем выше концентрация немеченого гормона, тем меньшим оказывается количество импульсов, связанных с антителами, присутствующими в системе в фиксированной концентрации. На рис.5—1 приведены различные часто применяющиеся способы графического изображения результатов радиоиммунологических исследований. Верхний график представляет собой кривую доза—реакция в логарифмических координатах, где по оси ординат отложено число импульсов гормона, связанного с антителами, приведенное к максимальному числу связанных импульсов (Во), когда инкубируются только антитела и меченый гормон (без немеченого). Это построение в системе logit-log координат обычно представляет собой прямую линию, что облегчает визуальную интерполяцию количества гормона в неизвестной пробе. С целью получения прямой линии, облегчающей визуальную интерполяцию количества гормона в неизвестных пробах, применяют различные способы трансформации данных. Большинство результатов радиоиммунологических определений подвергается машинной обработке, позволяющей избежать утомительных и длительных расчетов.
Получение высокоочищенных гормонов дало возможность разработать чувствительные радиоиммунологические методы для точного измерения низких физиологических уровней циркулирующих гормонов, требующие относительно малых объемов биологических жидкостей. Для чувствительных радиоиммунологических определений необходимо следующее 1 — высокоочищенный гормон, несущий радиоактивную метку с достаточно высокой удельной активностью, чтобы в каждую пробирку можно было вносить только «следовые» его количества; 2 — реактивы, используемые в реакции присоединения метки, не должны изменять иммунореактивности гормона в существенной степени; 3 — антитела с достаточно высокой чувствительностью (сродством) и специфичностью, чтобы определить низкие физиологические уровни нужного гормона; 4 — соответствующий препарат сравнения, по отношению к которому можно было бы интерполировать неизвестные концентрации гормона в неизвестной пробе. Препарат сравнения и исследуемый гормон должны одинаково взаимодействовать с антителами и давать параллельные кривые доза—реакция.
В надежных системах для радиоиммунологического определения концентрация меченого гормона и антител фиксирована. В связи с этим по мере увеличения концентрации немеченого гормон уменьшается вероятность связывания меченого гормона с антителами, что обусловливает обратное соотношение между числом молекул меченого гормона, связанных с антителами, и концентрацией немеченого гормона в реакционной смеси.
В отношении взаимодействия антигена с антителами принимаются некоторые допущения 1 — присутствующий гормон гомогенен и взаимодействует с антителами с равным сродством независимо от того, содержит он радиоактивную метку или нет; 2 — присутствующие антитела гомогенны и одна молекула антитела взаимодействует с одной молекулой гормона; 3 — два разных вида молекул — гормон и антитела — реагируют до тех пор, пока между ними не установится равновесие; 4 — применяется эффективное средство разделения связанного с антителами и свободного гормона, причем методика разделения не нарушает исходного равновесия, достигнутого между гормоном и антителами.
Хотя перечисленные допущения идеализируют ситуацию, но они приблизительно очерчивают условия радиоиммунологических исследований. С помощью соответствующих методов удается определить такие концентрации гормонов, которые обычно не поддаются определению большинством биологических методов in vivo. Под чувствительностью или наименьшей определимой дозой понимают ту концентрацию гормона, которая вызывает значимое изменение процента связывания меченого гормона с антителами при сравнении с «пустой» пробой. Чувствительность определения зависит от сродства гормона к специфическим антителам.