ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСЫВОРОТКИ
Антитела принадлежат к классу иммуноглобулинов и являются преимущественно g-глобулинами (IgG). Молекула IgG состоит из 4 полипептидных цепей: двух тяжелых и двух легких, расположенных симметрично и ковалентно связанных друг с другом дисульфидными мостиками. Схематическое изображение этой молекулы приведено на рис. 5—2. Взаимодействие антигена, или лиганда, с антителом можно уподобить контакту «замка и ключа». Форма комплексобразующего участка антитела комплементарна таковой участка антигена. Связь между антигеном и антителом обусловлена сочетанием электростатических, водородных и ван-дер-ваальсовых взаимодействий [31, 32]. Форму связывающего участка и тем самым сродство и специфичность связи молекулы IgG с нужным антигеном определяет аминокислотная последовательность комплексообразующего участка этой молекулы [33].
Для получения системы определения гормона высокоочищенный гормон вводят лабораторным животным, индуцируя у них синтез иммуноглобулинов, обладающих достаточно высокой специфичностью и чувствительностью, чтобы их можно было использовать для радиоиммунологических определений. Как правило, соединения с размерами молекул менее 1000 дальтон недостаточно иммуногенны и для придания им свойств активных нммуногенов их нужно соединять с молекулой-носителем. Иммуногеном называется вещество, способное индуцировать образование антител. Для того чтобы обеспечить возможность индукции антителообразования, небольшие молекулы, или гаптены, можно соединять с такими веществами, как альбумин, тироглобулин или гемоцианин. Иммуногенная реакция обычно выше в случае введения тех белков-носителей, которые и сами являются высокоиммуногенными. В связи с этим такие вещества, как альбумин, тироглобулин и гемоцианин являются более подходящими белками-носителями, чем полилизин или другие синтетические полиаминокислоты, при индукции синтеза специфических антител к конъюгированным гаптенам. Стероиды, тиреоидные гормоны (трийодтиронин и тироксин) и различные формы витамина D, как правило, требуют конъюгации с белками-носителями. Необходимо тщательно следить за тем, чтобы в процессе конъюгации стероидов и других гаптенов принимала участие та часть молекулы, изменение которой в наименьшей мере сказывалось бы на стереоспецифичности этой молекулы. Например, антитела к 17 b-эстрадиолу лучше всего образуются при ковалентном присоединении его 6-кетоаналога к альбумину, т. е. при сохранении интактности 3- и 17-гидроксильных групп, равно как и кольца А, стероида. Последнее особенно важно, поскольку именно эти структуры придают данному эстрогену специфичность.
За многие годы разработаны разнообразные методики иммунизации, но все они, по существу, являются модификациями оригинальной методики Фрейнда [34]. Эмульсия, содержащая гормон, или иммуноген, соответствующее масло и убитые нагреванием туберкулезные палочки, вводят внутри- или подкожно. С получением высокоочищенных гормонов и других производных удалось разработать методику иммунизации малыми количествами иммуногена [35]. Имеются надежные экспериментальные доказательства образования специфических обладающих высоким сродством антител к малым дозам иммуногена [36]. Именно малые дозы иммуногена с наибольшей вероятностью обусловливают продукцию специфических иммуноглобулинов теми клетками, которые образуют антитела с наиболее высоким сродством к иммуногену. В связи с этим при применении больших доз иммуногена повышается вероятность выработки антител, обладающих низким сродством. При введении очень больших доз иммуногена у иммунизированных животных может наблюдаться феномен толерантности, когда антитела вообще не образуются или образуются в очень низких титрах [37, 38]. После начальной иммунизации обычно должно пройти минимум 6 нед, чтобы появились значительные титры антител. Сродство антител продолжает увеличиваться и достигает максимума обычно между 8-й и 12-й неделей после начальной иммунизации [35, 39]. Эмпирически установлено, что повторная иммунизация животного обеспечивает лучшую реакцию в том случает, если повторные инъекции производят в период снижения титра циркулирующих антител. При повторном введении 1/2 или 1/4 дозы гормона, использованной при первичной иммунизации, значительное повышение титра циркулирующих антител наблюдается уже через несколько дней. Повторную иммунизацию животного следует производить в ту же анатомическую область, в которую иммуноген вводили первый раз. Больше того, для воспроизведения реакции «по памяти» уже не нужно вводить убитые нагреванием туберкулезные бациллы, которые могут увеличивать заболеваемость и смертность животных.
Для получения специфических антител следует выбирать те виды животных, которые легко доступны, не слишком дороги и у которых структура своего собственного эндогенного гормона значительно отличается от применяемого для иммунизации. Например, хотя СТГ у животных разных видов обладают одинаковой биологической активностью, но они существенно различаются по аминокислотному составу. Эти различия в первичной структуре, как и некоторые другие недостаточно охарактеризованные факторы определяют иммуногенность гормона для других видов животных. В некоторых случаях аминокислотные последовательности могут различаться относительно слабо и поэтому нужно с особой тщательностью подбирать вид животного, которому вводят гормон. Например, структура инсулина у человека, кролика и овцы почти одинакова, но инсулины человека и морской свинки различаются сильнее. Для получения специфических антител к инсулину человека лучше всего использовать именно морских свинок [40].