ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ СИСТЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
После получения антител от иммунизированного животного и определения их концентрации проводят оценку чувствительности и специфичности антисыворотки. Концентрацию антител в сыворотке вначале определяют по связыванию меченого гормона, который применяли для иммунизации, причем используют разные разведения антисыворотки. Этот способ называется титрованием и под титром понимают концентрацию молекул антител в сыворотке. После нахождения той концентрации антител, которая в равновесных условиях связывает 30—40% меченого гормона, определяют чувствительность и специфичность антител. Получение и характеристика специфических систем для определения ХГЧ и инсулина очень подробно изложена в других публикациях и может служить ориентиром при получении других специфических радиоиммунологических систем определения гормонов.
В реальных условиях антитела, получаемые для использования в клинических радиоиммунологических исследованиях, содержат популяцию иммуноглобулинов, обладающих различной специфичностью и сродством. Следует выбрать антисыворотку, содержащую популяцию антител с достаточно высоким сродством и специфичностью к тому гормону, который предстоит определить. На практике выбрать такую популяцию антител с высоким сродством можно путем достаточно высокого разведения антисыворотки, чтобы роль других популяций антител, обладающих низшим сродством и, возможно, неспецифических, стала относительно несущественной.
Рис. 5—3. Кривая доза — реакция для ХГЧ-a, определяемого в гомологичной для него радиоиммунологической системе. Три кривые доза — реакция для ХГЧ-а получены в условиях, отличающихся только концентрацией антител к ХГЧ-a. При увеличении начального отношения В/Т с 25 до 60% вследствие увеличения концентрации антител точка на оси абсцисс, соответствующая 50% снижению исходного связывания, сдвигается с 0,12 до 0,24 нг в пробе. 1 — В/Т=25%: 2 — В/Т=32%: 3 — В/Т =60%. Обозначения см. на рис. 5-1;
При выборе такого разведения антисыворотки, которое отличается от использованного вначале для характеристики системы, необходимо заново определить ее чувствительность и специфичность, поскольку в ином разведении концентрация других популяций антител может оказаться относительно высокой, и разведенная антисыворотка будет обладать меньшей чувствительностью и специфичностью. Такая ситуация графически представлена на рис. 5—-3, на котором кривая доза—реакция для высокоочищенного лиганда смещена вправо, что отражает снижение чувствительности системы по мере увеличения концентрации антител. Поскольку гормоны содержатся в крови в относительно низких концентрациях (10–12—10–9 М), необходимо отбирать антитела с высоким сродством и специфичностью. Сродство и специфичность каждого разведения антител нужно определять эмпирически. Больше того, антисыворотка, получаемая от одного и того же животного в разное время после иммунизации, может обладать существенно различающимися сродством и специфичностью по отношению к гормону, которым иммунизировали животное.