Медицина и здоровье

ИНСУЛИН

ИСТОРИЧЕСКИЙ ОЧЕРК

В 1899 г. фон Меринг и Минковский показали, что удаление поджелудочной железы у собак приводит к развитию тяжелых нарушений обмена глюкозы с повышением ее концентрации в крови и клинической картиной сахарного диабета. Предположе­ние о том, что этот эффект является следствием выпадения дей­ствия необходимого гормона, было подтверждено в 1921 г., когда

Бантинг и Бест приготовили экстракт поджелудочной железы, способный снижать уровень сахара в крови. Это вещество, на­званное инсулином, .было получено в кристаллическом виде Абе­лем в 1926 г. Sanger определил аминокислотный состав инсули­на — первого белка, последовательность которого была полностью расшифрована. В 1965 г. Katsoyannis сумел осуществить хими­ческий синтез инсулина. В 1969 г. с помощью методик рентгенодифракции была определена трехмерная структура инсулина. Steiner в 1967 г. обнаружил проинсулин — биологический пред­шественник инсулина более крупного размера. Позднее с по­мощью методик рекомбинаций ДНК удалось добиться синтеза инсулина бактериями.

ХИМИЯ

Молекула инсулина состоит из двух полипептидных цепей, обоз­начаемых как А- и В-цепи, соединенные двумя дисульфидными мостиками. Кроме того, имеется дисульфидный мостик между 6-м и 11-м аминокислотным остатком А-цепи (рис. 10—10). Пол­ная молекула содержит 51 аминокислоту и обладает относитель­ной молекулярной массой 5800 и изоэлектрической точкой 5,35; 1 мг чистого вещества содержит 24 ME. Аминокислотный состав инсулина у разных видов постоянен, за исключением остатков в положениях 4, 8, 9 и 10 А-цепи и 1, 2, 3, 27, 29 и 30 В-цепи. Чаще всего применяемыми в клинических целях инсулинами яв­ляются гормоны, экстрагируемые из поджелудочных желез сви­ней и крупного рогатого скота. Свиной инсулин отличается от гормона человека только присутствием аланина вместо треонина в терминальном положении В-цепи, тогда как между бычьим и человеческим инсулином существуют еще два различия [в 8-м (аланин) и 10-м (валин) положениях А-цепи] (см. рис. 10—10). Согласно результатам рентгенокристаллографических исследова-

Рис. 10—10, Аминокислотная последовательность инсулина человека. Сви­ной инсулин в качестве терминальной аминокислоты В-цепи содержит не треонин, а аланин. Бычий инсулин отличается от инсулина человека тем, что содержит аланин в положении 30 В-цепи, а также аланин (вместо трео­нина) в положении 8 и валин (вместо изолейцина) в положении 10 А-цепи.

яий, единичная ячейка кристаллического свиного инсулина со­стоит из инсулинового гексамера, построенного из трех димеров, расположенных вокруг оси, на которой лежат два атома цинка. Содержание цинка в большинстве кристаллических препаратов инсулина составляет примерно 0,4—0,5%. В слабых растворах инсулин адсорбируется на стекле или пластмассе (например, на стенках системы для внутривенных инфузий). Эту адсорбцию удается свести к минимуму путем добавления альбумина.

Расщепление инсулина на составляющие его А- и В-цепи пу­тем окисления или восстановления дисульфидных мостиков при­водит к полной потере им биологической активности. С другой стороны, удаление амидной группы аспарагина на карбоксильном конце А-цепи или терминального аланина В-цепи практически не влияет на активность молекулы инсулина. При удалении всего аспарагина (или аспартата) из карбоксильного конца А-цепи и аланина из соответствующего участка В-цепи теряется примерно 95% активности гормона. Удаление последовательности из 8 ами­нокислот (с 23-го по 30-й остаток) с карбоксильного конца В-цепи (инсулин-дезоктапептид) с помощью трипсинового гидролиза приводит к исчезновению всей определимой активности. Считает­ся, что участок между 22-м и 26-м остатком В-цепи имеет реша­ющее значение для связывания инсулина с его рецептором, как и для действия инсулина вообще [27].

БИОСИНТЕЗ

Инсулин синтезируется b-клетками островков Лангерганса в виде одноцепочечного предшественника — проинсулина с молекуляр­ной массой около 9000 [28]. Современные исследования на бес­клеточных системахпоказывают, что ближайшим продуктом трансляции проинсулиновой мРНК является более крупный пеп­тид с молекулярной массой 11 500, содержащий 23 дополнитель­ных аминокислотных остатка на аминоконце молекулы. Этот предшественник получил название препроинсулина, и счи­тают, что он быстро (в течение нескольких минут после синтеза) расщепляется микросомными протеазами до проинсулина. Допол­нительный пептид в препроинсулине по своему размеру, содер­жанию отдельных аминокислот и положению на аминоконце схо­ден с дополнительными последовательностями, найденными в продуктах трансляции in vitro мРНК различных гормонов, таких, как пропаратиреоидный гормон и гормон роста, равно, как и негор­мональных белков, таких, как легкие цепи иммуноглобулинов [29].

Проинсулин представляет собой спиральную молекулу, в ко­торой А- и В-цепи составляют единую последовательность за счет соединяющего пептида (С-пептида), состоящего из 26—31 ами­нокислотного остатка (рис. 10—11). Если аминокислотные по­следовательности А- и В-цепей у разных видов имеют небольшие различия, то строение соответствующих С-пептидов разнится го-

Рис. 10—11. Схематическое изображение биосинтеза проинсулина, его пре­вращения в инсулин и С-пептид. Ген проинсулина представлен в верхней части рисунка. Эти гены содержат интроны, продукты которых исключа­ются из состава зрелой мРНК. Транскрипция препроинсулиновой мРНК требует присутствия фермента РНК-полимеразы. Эта мРНК служит мат­рицей для образования цепей препроинсулина на полирибосомах. Препроинсулин расщепляется до проинсулина (средняя часть рисунка), который затем переносится в аппарат Гольджи (пластинчатый комплекс), где и про­исходит его превращение в инсулин (по Steiner D. F., Diabetes, 1977, 26, 322). раздо больше. Так, инсулин свиньи отличается от инсулина че­ловека только одной аминокислотой, тогда как С-пептид челове­ка — цепь из 23 аминокислотных остатков с молекулярной массой 3021 — отличается от свиного С-пептида 10 остатками и содержит на 2 аминокислоты меньше [30]. Столь высокая «мутабельность» согласуется с отсутствием у С-пептида специфической гормональ­ной функции. Хотя проинсулин обнаруживает небольшую пере­крестную реакцию с антителами к инсулину, он обладает всего" 3—5% от биологической эффективности нативного инсулина, Не ясно, принадлежит ли эта небольшая биологическая, актив­ность непосредственно проинсулину, или она обусловлена его превращением тканями-мишенями в инсулин.

Синтез препроинсулина в клетке и его быстрое? расщепление-до проинсулина происходит на полисомах шероховатого эндоплаз­матического ретикулума. Затем в ходе энергозависимого процесса проинсулин переносится в пластинчатый комплекс (аппарат Гольджи), где происходит его упаковка в микропузырьки с глад­кой поверхностью, в форме которых и осуществляется хранение и секреция (см. рис. 10—11). С момента попадания в пластинча­тый комплекс и в секреторных гранулах мембранные протеазы расщепляют проинсулин на эквимолярные количества инсулина и С-пептида. Инсулин вместе с цинком накапливается в централь­ной области созревающей секреторной гранулы, приобретающей все большую электронную плотность; С-пептид локализуется в пе­риферическом прозрачном пространстве секреторной гранулы.

Высвобождение содержимого зрелых секреторных гранул про­исходит путем постепенного их продвижения к плазматической мембране клетки, вслед за чем инсулин и С-пептид выталкива­ются наружу. Движение гранул к плазматической мембране в цитозоле b-клеток направляется микротрубочками — структурами, имеющими диаметр 24 нм и состоящими из димерных субъединиц белка с молекулярной массой 120 000, известного под названием тубулин. Вблизи плазматической мембраны, окружая секретор­ные гранулы, располагается сеть микронитей — структур с диа­метром 4—8 нм и состоящих, как полагают, из сократительного| белка актина. Принято считать, что на конечном общем этапа секреции b-клеток начинается поступление кальция внутрь клет­ки, что приводит к сокращению микронитей [31]. В результате секреторные гранулы приближаются к поверхности клеток, где их мембраны сливаются с плазматической мембраной, а их со­держимое выбрасывается во внеклеточное пространство. Этот про­цесс слияния мембран называется эмиоцитозом или экзо­цитозом.

Недавняя разработка методов химического синтеза ДНК в со­четании с использованием рекомбинаций ДНК обусловила воз­можность получения крысиного проинсулина или отдельных А- и В-цепей инсулина человека с помощью бактериальных клеток (Escherichia coli) [26, 32]. План синтеза предполагает либо об­ратную транскрипцию проинсулиновой мРНК с тем, чтобы полу-

Рис. 10—12. Схематическое изображение синтеза А- и В-цепей инсулина бактерий (Е. coli) с помощью методики рекомбинации ДНК (по Riggs A., Itakura К., Am. J. Hum. Genet, 1979, 31, 351). чить кДНК (ДНК-«копию») для проинсулина, либо химический синтез меньших фрагментов ДНК, кодирующих А- и В-цепи ин­сулина человека. Синтетические гены затем объединяются с ге­ном, в норме экспрессированном в клетке Е. coli (например, геном пенициллиназы или b-галактозидазы), что обеспечивает эф­фективную транскрипцию и трансляцию, т. е. образование стабильного белка-предшественника, или (в случае периплазматического белка, такого, как пенициллиназа) способствует транспорту продукта из клетки. Векторами, применяющимися для вне­сения чужеродной и бактериальной ДНК в бактериальную клет­ку, служат либо бактериофаги, либо плазмиды. Бактерия, содержащая плазмиду, транскрибирует свой собственный ген, рав­но, как и внедренную последовательность, продуцируя тем самым нужный полипептид (рис, 10—12). Тот факт, что последователь- ность эукариотической ДНК удается клонировать и экспрессиро­вать в прокариотических (бактериальных) клетках, может найти наиболее быстрое применение в области использования бактери­ального синтеза для продукции инсулина человека, нужного для лечения больных с инсулинозависимым диабетом. Такая техноло­гия тем самым может обеспечить создание альтернативного источ­ника инсулина и в конце концов вытеснить современные способы получения гормона, заключающиеся в экстракции свиных и бычьих поджелудочных желез.

<< Prev - Next >>