РАЗДЕЛЕНИЕ ЛИПОПРОТЕИНОВ
Показания
Диагноз большинства форм гиперлипидемии можно поставить с помощью точного определения уровня холестерина и триглицеридов в сочетании с визуальной оценкой состояния плазмы, хранимой в течение 12—18 ч при 4°С. Исключением являются больные с повышенным содержанием как холестерина, так и триглицеридов в плазме, когда невозможно разграничить гиперлипидемию На и 116 типов, а также больные, у которых требуется определить уровень ЛПВП. В первом случае методом выбора служит ультрацентрифугирование плазмы в градиенте плотности, при котором всплывают ЛПОНП, с последующим определением отношения холестерина ЛПОНП к общему содержанию триглицеридов. Как отмечалось, этот метод предпочтительнее выявления b-мигрирующей полосы при электрофорезе ЛПОНП, выделенных с помощью ультрацентрифугирования. Авторы считают, что в настоящее время практически нет оснований для проведения электрофореза цельной плазмы и что информативность этой методики весьма мала.
Возможные методы
Липопротеины можно разделять с помощью трех методов: электрофореза, ультрацентрифугирования и осаждения. Обычно пользуются электрофорезом на бумаге, ацетате целлюлозы или агарозе, но этот метод неточен и данные, получаемые с его помощью, нелегко интерпретировать количественно в плане содержания липидов в липопротеинах отдельных классов. Разделение плазмы с помощью ультрацентрифугирования — наиболее точный метод, но он занимает много времени и требует наличия ультрацентрифуги. Подробное описание методов выделения ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП содержится в других публикациях [73] и не входит в задачи настоящей главы. Все большее признание приобретают в настоящее время методы, основанные на осаждении, принцип которых сводится к взаимодействию между липопротеинами более низкой плотности (ЛПОНП и ЛПНП), сульфатированными полисахаридами и двухвалентными катионами. Например, супернатант, образующийся после осаждения ЛПОНП и ЛПНП гепаринмарганцем, содержит только ЛПВП и может быть использован для определения содержания холестерина в этих липопротеинах. Для получения дополнительных данных этот метод сочетают с двумя другими. Первый из них заключается в удалении ЛПОНП из субнатанта с d= 1,006, содержащего ЛПНП и ЛПВП, с помощью ультрацентрифугирования. Определение содержания липидов в цельной плазме, гепаринмарганцевом супернатанте цельной плазмы (ЛПВП), а также во фракциях ЛПОНП и ЛПНП совместно с ЛПВП, полученных при ультрацентрифугировании, позволяет количественно охарактеризовать ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП. При втором, более простом, методе, не требующем ультрацентрифугирования, получают косвенные значения для ЛПОНП и ЛПНП и прямые для ЛПВП. Этот метод основан на предположении, что концентрация холестерина ЛПОНП примерно равна общему уровню триглицеридов в плазме, деленному на 5. Определяют уровень липидов в цельной плазме и гепаринмарганцевом супернатанте (ЛПВП) и нужные концентрации вычисляют следующим образом Холестерин ЛПВП = холестерин в гепаринмарганцевом супернатанте; холестерин ЛПОНП = общие триглицериды плазмы : 5; холестерин ЛПНП = общий холестерин плазмы—(холестерин ЛПВП + холестерин ЛПОНП).
Этот метод нельзя применять при концентрации триглицеридов более 4000 мг/л или в присутствии хиломикронов либо липопротеинов промежуточной плотности, появляющихся при гиперлипидемии III типа.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ПРОБЫ
Отношения неэстерифицированный холестрин/общий холестерин
При обструктивных заболеваниях печени, первичном билиарном циррозе и недостаточности ЛХАТ увеличивается относительное содержание неэстерифицированного холестерина. Определение этого отношения требует экстракции липидов плазмы смесью хлороформа с метанолом и разделения свободного и эстерифицированного холестерина с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках, покрытых кремниевой кислотой.
Определение липопротеиновой липазы
Существуют две пробы, способствующие дифференциации гиперлипидемии на I и V типы. В соответствии с первым из них, натощак и через 10 мин после внутривенной инфузии 10 ЕД/кг натриевой соли гепарина берут пробы крови и проводят электрофорез плазмы из обеих проб на бумаге или агарозе. При гиперлипидемии 1 типа электрофореграммы обеих проб идентичны, тогда как при гиперлипидемии V типа на электрофореграмме постгепариновой пробы будет наблюдаться смазанность b- и пре-бета-полос и очень четкая a-полоса. К сожалению, интерпретация результатов этого теста весьма субъективна и не исключает ошибок. Второй тест более специфичен и основывается на определении активности постгепариновой липопротеиновой липазы. Внутривенно вводят соль гепарина (100 ЕД/кг); через 30 мин в пробирку с ЭДТА (в качестве антикоагулянта) помещают пробу крови, и в плазме определяют активность липопротеиновой липазы. Поскольку постгепариновая плазма содержит два фермента: липопротеиновую и печеночную липазы, первый из которых при гиперлипидемии I типа отсутствует, важно, чтобы тест-система могла бы дифференцировать эти ферменты. Этого удается достичь путем ингибирования липопротеиновой липазы протамин-сульфатом или хроматографическим разделением ферментов на гепаринсефарозной колонке. С практической точки зрения и в силу стабильности липопротеиновой липазы при хранении при температуре —20 °С лучше, вероятно, отсылать такие пробы в центры, специально занимающиеся метаболизмом липопротеинов, в которых регулярно проводятся соответствующие анализы.