Тесты активации клеток аллергенами (CAST)
Тесты активации клеток аллергенами (CAST) являются современными методами диагностики ГНТ медиаторного типа, не обусловленной IgE (рис. 10).
Рис. 10. Принцип постановки CAST/FAST:
1 — стимуляция базофилов (IgE-зависимая, с помощью аллергена; с помощью анти-FceRI-антител; IgE-независимая, с помощью пищевых добавок, нестероидных противовоспалительных средств (аспирин), лекарственных препаратов); 2 — идентификация базофилов. Проводится только для FAST, обычно с помощью меченых антител против IgE или рецепторов к хемокинам CCR3; 3 — учет реакции. CAST учитывают
с помощью количественного определения лейкотриенов (тИФА). FAST — путем определения процента активированных базофилов (экспрессирующих CD63) с помощью цитофлуориметрии
Ранее подобную реактивность выявляли в тестах повреждения лейкоцитов и стимуляции выделения гистамина базофилами, однако они слишком трудоемки, плохо воспроизводятся и не поддаются стандартизации. СAST/FAST ставится в несколько стадий:
1. Выделение лейкоцитов крови:
а) к стабилизированной крови добавляют декстран для осаждения эритроцитов;
б) надосадок центрифугируют для осаждения лейкоцитов (удаление декстрана и тромбоцитов);
в) осадок лейкоцитов ресуспендируют в буферном растворе, содержащем ИЛ3.
2. Стимуляция лейкоцитов:
а) с анти-FceRI-антителами (положительный контроль);
б) физиологическим раствором (отрицательный контроль);
в) аллергеном(ами) в различных концентрациях.
3. Супернатанты отбирают и немедленно определяют содержание лейкотриенов с помощью твердофазного ИФА. Для количественного
определения необходимо использовать несколько разведений стандартов для построения калибровочной кривой.
4. Интерпретация теста. Для пищевых аллергенов нижний (пороговый) уровень (cut off) обычно равен 400 пг/мл; для пищевых добавок,
лекарственных аллергенов, аэроаллергенов — около 40 пг/мл.
FAST отличается от CAST способом учета активированных базофилов: обнаружение и подсчет процента клеток, экспрессирующих CD63
и связанные IgE (рис. 11). Интересующие нас клетки должны иметь связанные на поверхности IgE, т. е. связывать анти-IgE-антитела, меченные FITC, и сильно светиться зеленым. Активированные тучные клетки,
помимо этого, экспрессируют CD63, связывают анти-CD63-антитела,
меченные РЕ, и светятся красным. Таким образом, тест положительный, если значительный (>5–15 %) процент клеток (точки на графике) обнаруживается во втором квадранте. В настоящее время существуют коммерческие наборы для постановки комбинированных тестов (CAST и FAST
в одной пробирке).
Следует отметить, что CAST/FAST выявляет выделение лейкотриенов лейкоцитами как в связи, так и без наличия аллерген-специфических IgE. Основные показания для применения CAST/FAST: подозрение на ГНТ по медиаторному типу и отсутствие специфических IgE; наличие гиперчувствительности к пищевым добавкам и лекарственным аллергенам; диагностика аспириновой астмы и подобных состояний. CAST/FAST не рекомендуются как тесты для первичного аллергологического обследования (они сложнее, дороже и уступают стандартным тестам обнаружения специфических IgE (UniCAP и т. д.)).
а б
Рис. 11. Учет FAST:
а — отрицательный контроль; б — положительный контроль. Обозначения: PE —
фикоэритрин (красное свечение); FITC — флуоресцеин (зеленое свечение); Q1-4 — квадранты на графике распределения клеток (Q1 — сильное красное свечение, слабое зеленое; Q2 — сильное красное и сильное зеленое; Q3 — слабое красное и слабое
зеленое; Q4 — слабое красное и сильное зеленое свечение)
Методы, направленные на исследование проаллергических
цитокинов и медиаторов иммунного воспаления.