МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Приоритетными направлениями микробиологической диагностики являются генодиагностические технологии. Особенно они актуальны при идентификации штаммов, находящихся в не культивируемом состоянии. Перспективное направление генодиагностики – это биологические микрочипы, которые могут явиться технологией индикации широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, их антибиотикорезистентности в ходе анализа единичных клинических проб.
Двойная спираль ДНК построена из дискретных нитей, удерживаемых вместе водородными связями между собой комплиментарными основаниями (аденин-пурин; гуанин-цитозин). Водородные связи непрочные, и могут быть разделены при нагревании до 95-1000С, а при понижении температуры происходит их соединение по принципу комплиментарности, с образованием двухцепочечной нити ДНК (гибридизация). Этот процесс протекает только при генетической родственности пары. Из одной из нитей выделяют и искусственно синтезируют фрагмент (зонд), который будет взаимодействовать только с комплиментарной для себя последовательности ДНК-мишени. Это служит основой для проведения высокоточных и специфичных гибридизационных тестов. Наиболее распространены методы гибридизации ДНК или РНК, полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Гибридизация ДНК или РНК
Принцип метода обусловлен способностью ДНК (и РНК) специфически соединяться (гибридизироваться) с комплиментарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (и РНК), меченных изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). Технически гибридизационные тесты сводятся к следующему. Одноцепочечный ДНК-зонд метится изотопом, ферментом или иной распознаваемой меткой. Исследуемый материал обрабатывают в режиме, позволяющем разрушить микроорганизмы, высвободить и денатурировать ДНК (т.е. расчленить её на одиночные нити). После инкубации зонда с исследуемым образцом измеряют количество меченой ДНК, связавшейся (вступившей в гибридизацию) с нуклеиновыми кислотами тест-препарата. Разновидности метода:
q Гибридизация на фильтре;
q Гибридизация в растворе;
q Гибридизация in situ.
В дальнейшем образцы исследуются методом ИФА, световой микроскопии.
Пример реагентов: исследование папилломавирусной инфекции методом гибридизации in situ- для его проведения применяют световой микроскоп, термостат, комплект реагентов для выполнения гибридизации, время исследования 2,5 часа («ЛабМетод», РФ).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Принцип метода: катализация ДНК-полимеразой многократного образования копий (амплификация) определенного участка ДНК. Этапы метода: термическое разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки (30-40 с при 93-950С), охлаждение среды и внесение праймеров, комплиментарных нуклеотидным последовательностям обеих цепочек. Для запуска реакции используют синтетические праймеры – олигонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеотидов, взаимодействующих с окончаниями последовательностей и образующие последовательности 50-1000 оснований. Затем в среду вносят термостабильную tag (по названию бактерии Thermus aquaticus)-полимеразу, что запускает образование вторичных копий цепей ДНК, после чего образующиеся двухнитевые молекулы ДНК снова подогревают. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праймеры и снова повторяют процедуру подогрева и охлаждения; термостабильность полимеразы обусловливает стабильность фермента и отсутствие необходимости в его повторном внесении. После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их идентификацию методом электрофореза. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю молекулы можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или провести реакцию ДНК- гибридизации. ПЦР – высоко чувствительный метод.
В последнее время созданы и модификации ПЦР: ПЦР в сочетании с обратной транскрипцией; лигазная полимеразная реакция (использование ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы); прямая репликация рибосомальных РНК (при помощи РНК-полимеразы).
Примеры реагентов: 1. московский центр «Авиценна» предлагает наборы реагентов для обнаружения ДНК/РНК: HBV-ПЦР (ДНК вируса гепатита В); HBС-ПЦР (РНК вируса гепатита С); HSV-ПЦР(ДНК вируса простого герпеса 1 и 2 типов); HHV- ПЦР(ДНК вируса герпеса человека 6 типа); HCMV-ПЦР(ДНК цитомегаловируса); HEBV-ПЦР(ДНК вируса Эпштейн-Барр); HPVgen-ПЦР(ДНК вируса папилломы всех типов); H.Pyl.-ПЦР(ДНК H.pylori); Ch.pn.-ПЦР(ДНК C.pneumoniae); Ch.T.- ПЦР (ДНК C.trachomatis); а также к уреаплазмам (Ur.Ur.- ПЦР) и микоплазмам (M.pn.- ПЦР; M.Hom.- ПЦР; M.Gen.- ПЦР), токсоплазмам (T.gon.- ПЦР), трихомонадам (T.vag.- ПЦР), гарднереллам (G.Vag.- ПЦР), нейссериям (N.Hon.- ПЦР), микобактериям (M. Tub.- ПЦР). 2. «АмплиСенс» (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ). 3. ЗАО «Внедрение систем в медицину».
ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR)
Метод количественного определения продуктов ПЦР непосредственно во время амплификации (Real-Time) стал одним из наиболее популярных методов в клинической генодиагностике и научных исследованиях [Godfrey T., et al., 2002].
Одна из наиболее значимых проблем ПЦР-диагностики – возможность получения ложноположительных результатов вследствие контаминации продуктами реакции. Исключение контаминации требует безукоризненного выполнения целого списка требований [Колупаев В.Е., 2002]. В условиях постоянного увеличения потока анализов вероятность контаминации из-за ошибок персонала непрерывно возрастает, а определение источника требует много времени и средств. Успехи флюориметрических технологий, разработка аппаратуры для измерения концентрации ампликонов непосредственно в ходе реакции. Позволили создать метод ПЦР в реальном времени [Higuchi R.,1993]. Внедрение этого метода в лабораторную практику позволило полностью отказаться от отдельного этапа регистрации, а также:
q Устранить угрозу контаминации специфическими продуктами реакции;
q Снизить строгие требования к организации лабораторного процесса;
q Сократить трудозатраты и время анализа;
q Проводить ПЦР-анализы в одном помещении.
Принцип метода – детекция одновременно с амплификацией. Он основан на измерении флюоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации. Это дает возможность оценить течение процесса, которое зависит от начального количества исследуемого генетического материала. Было показано, что в сравнении с другими количественными методами ПЦР- диагностики ПЦР в реальном времени является наиболее эффективной и наименее трудоемкой методикой [Bustin S.A., 2000]. Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют следующие методы:
1.Интеркалирующие красители. Этот способ детекции основан на том, что флюоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двойную цепь молекулы ДНК. Добавление этих красителей в реакционную смесь позволяет наблюдать за накоплением продуктов амплификации непосредственно во время реакции.
2.ДНК-зонды. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флюоресцентная метка и гаситель флюоресценции. Когда зонд находится в растворе, гаситель поглощает излучение и свечение отсутствует. В ходе ПЦР происходит присоединение ДНК-зонда к комплиментарной цепи ДНК, одновременно разъединяются флюоресцентная метка и гаситель, что приводит к увеличению детекции свечения. Чем больше ампликонов было наработано в данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение.
Оборудование.
Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный прибор, который состоит из трех блоков: амплификатора (термического блока), флюоресцентного детектора и компьютера. Примеры реагентов: наборы реактивов производит ЗАО «Внедрение систем в медицину» (Россия), «ЛабМетод» (Россия), «АмплиСенс» (ЦНИИЭ МЗ РФ).