Метод культивирования
Рекомендуются следующие среды, наиболее простые по составу и дающие удовлетворительные результаты для культивирования дизентерийных амеб и других простейших кишечника (за исключением лямблий):
- Простая сывороточная среда - смесь из 9 частей стерильного изотонического раствора (0,85%) и 1 части нормальной лошадиной (или бычьей) сыворотки, разлитая в пробирки по 8-10
мл.
- Двухфазная сывороточная среда - на 19 частей бычьей сыворотки добавляют 1 часть мясопептонного бульона с 2% раствором глюкозы. Можно использовать также сыворотки других животных и остатки сывороток человека, поступающих в лабораторию для диагностических исследований. Смесь свертывают при 80оС в течение 2 ч в косом положении, охлаждают, а затем заливают стерильным изотоническим раствором так, чтобы он перекрывал на 1 см верхний край скоса.
- Среда Павловой - хлорида натрия 8,5 г, двузамещенного фосфорно-кислого натрия 0,59 г, однозамещенного фосфорно-кислого калия 0,45 г, дистиллированной воды 1000 мл. После стерилизации в автоклаве (30 мин при давлении 1,5 атмосферы) и охлаждения в раствор добавляют стерильную лошадиную (или бычью) сыворотку в соотношении 1:20 и разливают среду в стерильные пробирки по 5 - 7 мл.
- Среда Райса представляет собой смесь 1 части мясопептонного бульона с 4 частями изотонического раствора, к которой добавляется нативная лошадиная или бычья сыворотки в соотношении 1:10. Среду стерильно разливают в пробирки по 8 - 10 мл.
Могут быть использованы и другие, более сложные по составу среды. Для получения первичных культур простейших в пробирки со средой, предварительно проверенные на стерильность выдерживанием в термостате при температуре 37оС в течение суток (или при комнатной температуре 3 сут.), вносится комочек оформленного кала величиной с горошину или 2 - 3 капли жидкого материала. Смесь гомогенизируют встряхиванием. Засевать одновременно нужно несколько пробирок (2 - 3). Перед посевом пробирки со средами подогревают до температуры 37 о С и в каждую добавляют 1 - 2 петли рисового крахмала. Его предварительно стерилизуют сухим жаром при температуре 90 оС по 1 часу 4 дня подряд в пробирках, закрытых ватными пробками. Оптимальной температурой для культивирования является 37 оС. Результаты проверяются через каждые 24 ч в течение 5 сут. Для проверки со дна пробирки с помощью пипетки забирают каплю осадка с небольшим количеством жидкости, помещают на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.
Микрометрия. Размеры простейших и их ядер имеют важное значение для определения вида. Измерение производится при помощи окулярного микрометра представляющего собой линейку длиной 5 мм или 1 см с делениями, соответствующими 0,1 мм. Линейка нанесена на стекло, вмонтированное или вставляемое временно в окуляр микроскопа. Значение делений окулярного микрометра по отношению к измеряемым объектам для разных систем микроскопов и разных объективов предварительно определяется при помощи объектмикрометра. Он представляет собой линейку с делениями в 0,01 мм (10 мкм) на предметном стекле. Объектмикрометр помещают под объектив микроскопа и совмещают его линейку с линейкой окулярного микрометра. Устанавливают, какое число делений окулярного микрометра точно совпадает с определенным числом делений объектмикрометра. По этим данным вычисляют значение одного деления окулярной линейки в микронах или микрометрический коэффициент. Например, 10 делений окулярного микрометра соответствуют 2 делениям объектмикрометра. Тогда значение одного деления (микрометрический коэффициент) составит (2Х10)/10=2мкм. Вычисление микрометрического коэффициента производят с точностью до десятых или (реже) сотых долей микрона. Для измерения какого-либо микроскопического объекта следует заменить обычный окуляр на микрометрический (или вставить в него микрометрическую линейку), определить в делениях последнего длину и ширину объекта (клетки простейшего, ее ядра) и, перемножив число делений на микрометрический коэффициент, найти размеры объекта в микронах. Точно так же измеряются другие объекты: яйца и личинки паразитических червей, псевдопротозойные образования и др.
Лабораторная диагностика гельминтозов
Техника микроскопии яиц и личинок гельминтов
Просмотр препарата при гельминтоовоскопии или выявлении личинок следует начинать при малом увеличении микроскопа (объектив 8х или 10х). Обнаруженные яйца или личинки гельминтов в случае необходимости рассматриваются под большим увеличением. Препарат просматривается полностью; поля зрения последовательно чередуются по горизонтали или в вертикальном направлении. Поле зрения не должно быть слишком ярким, так как на ярко освещенном фоне плохо заметны яйца с тонкой бесцветной и прозрачной оболочкой (яйца остриц, карликового цепня, анкилостомид, кошачьей двуустки и некоторых других гельминтов).