Медицина и здоровье

Иммуноферментная диагностика паразитарных инвазий

Основной отличительной чертой иммуноферментного анализа (ИФА) является то, что в качестве индикаторной молекулы, которая позволяет следить за иммунным комплексом, исполь­зуется молекула фермента. В связи с тем что фермент обладает уникальным свойством модифици­ровать не одну, как в обычных химических реакциях, а большое число молекул субстрата, т. е. обладает своего рода усиливающим свойством, чувствительность иммуноферментных методик может быть очень высока. В некоторых случаях, как показывают многочисленные сравнительные исследования, она выше чувствительности иммунофлуоресцентных и радиоиммунологических ме­тодов.

История создания иммуноферментных методик начинается с момента, когда биохимики начали ковалентно иммобилизовывать («пришивать») молекулы ферментов к молекулам белков и, в частности, к молекулам иммуноглобулинов. Однако потребовалось пять лет для создания методики иммуноферментного анализа именно в том виде, в каком мы используем его в настоящее время. Принципы этого метода следующие:

— комплекс антиген — антитело можно выявить, если ввести в состав одного из участников иммунной реакции (ковалентно «пришить») одну или несколько молекул фермента. Причем эта процедура на промежуточных (в процессе «пришивки») и финальной стадии (конъюгат антигена или антитела с ферментом) не должна изменять иммунные свойства фермент-меченного участника иммунной реакции;

— удобно выявлять иммунный комплекс, используя способность фермента расщеплять суб­страт, который при ферментативной модификации изменяет свой цвет. В этом случае для выявле­ния комплекса антиген — антитело обычно используют спектрофотометрию;

— иммунный комплекс можно выявлять с помощью иммуноферментного анализа как в рас­творе, так и при адсорбции (или ковалентной иммобилизации) на твердом носителе.

Различают два принципиально различных типа ИФА — гомогенный и гетерогенный (твер-дофазный) иммуноферментный анализ.

Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) — наиболее простой в методическом от­ношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом и за ходом формирования комплекса анти­ген-антитело следят, регистрируя изменение активности фермента.

Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за счет пространственного разобщения фермента и субстра­та, либо за счет конформационных изменений в молекуле фер­мента , сопровождающих формирование иммунного ком­плекса

ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед другими с иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия (весь анализ с помощью ГИФА занимает минуты и даже доли минут). . Во-вторых, метод имеет одну стадию и не требует трудоемких этапов промывки. И, наконец, в-третьих, метод требует минимальных объемов (8—50 мкл) и количеств биологического или клинического образца. Однако у метода ГИФА имеется один крайне существенный недостаток — на его основе можно создавать диагностические тест-системы только для низкомолекулярных антигенов. Только в этом случае антитело, взаимодействуя с антигеном, может эффективно экранировать или модифицировать связанную с этим антигеном молекулу фермента. Именно в связи с этим, несмотря на кажущуюся простоту и очевидные преимущества перед другими методами, на основе ГИФА были созданы диагностикумы для выявления только гормонов, пептидов, лекарственных и наркотических веществ и некоторых низкомолекулярных белков.

Гетерогенный (твердофазный) иммуноферментный анализ (ТФИФА или ELISA) в последние годы особенно широко используется в биологии и медицине. Как и для других твердофазных методов анализа, характерной особенностью ТФИФА является то, что в процессе проведения анализа один из участников реакции антиген — антитело иммобилизуется на твердом носителе. Эту фиксацию антигена или антител можно осуществлять либо путем их ковалентной «пришивки» к полимерной или стеклянной матрице, либо путем их физической адсорбции на твердом носителе за счет достаточно прочных сил электростатического и ван-дер-ваальсового взаимодействия. Идея иммобилизации иммунного комплекса важна для анализа многокомпонентных смесей макромоле­кул, когда в системе должны оставаться только те компоненты смеси, которые обладают нужными иммунохимическими свойствами. Именно твердофазные методики позволяют избавиться от бал­ластных, не вошедших в иммунный комплекс антигенов простой промывкой.

Необходимо отметить, что в своей физико-химической основе твердофазный ИФА очень сходен с твердофазным РИА. Отличие касается лишь индикаторных молекул — в ТФИФА это фермент, в твердофазном РИА это радиоактивные изотопы. Остальные же принципы анализа полностью совпадают — в обоих методах используется твердая матрица, на которой адсорбирует­ся иммунный комплекс, и идентичный способ удаления из системы не вошедших в комплекс компонентов диагностикума. Поэтому многочисленные варианты различных схем анализа, приве­денные ранее для твердофазного РИА, могут быть использованы для описания методик анализа, применяемых при постановке ТФИФА.

Для обнаружения в биологических и клинических образцах паразитарных анти­генов особенно часто применяется так называемый сэндвич-метод или модифицированный сэнд­вич-метод. При использовнии этих методик на твердую подложку (обычно полистирол) сорбируются последовательно первичные антитела, выявляемый антиген и вторичные антитела. В случае двойного сэндвич-метода ферментная метка вводится в состав вторичных антител, в случае модифицированного двойного сэндвич-метода вторичные антитела (немеченые) «проявляются» антивидовыми меченными ферментом иммуноглобулинами. Особая популярность последней раз­новидности ТФИФА объясняется тем, что для выполнения методики нет необходимости синтезиро­вать специфические для каждого конкретного антигена конъюгаты (меченные ферментом анти­тела).

В последние годы были разработаны методики ТФИФА, использующие в качестве «проявля­ющих» конъюгатов молекулярные комплексы ферментов с белком А золотистого стафилококка. Как известно, это белок взаимодействует с высокой константой связывания с тяжелой цепью (Fc-фрагментами) иммуноглобулинов. Это позволяет построить диагностические системы, где в качестве «проявляющего» агента используются не антивидовые антитела, а белок А. В этом случае, однако, возникают некоторые трудности, связанные с неспецифичностью белка А, который взаимодействует с Fc-фрагментами любых антител. Если использовать обычную сэндвич-методи­ку, заменив лишь антивидовой конъюгат на конъюгат на основе белка А, последний будет взаимодействовать не только со вторичными антителами, но и с первичными иммуноглобулинами, давая положительную реакцию, даже если проба не содержит искомого антигена. В этом случае имеется несколько вариантов решения проблемы. Во-первых, в качестве первичных антител в ме­тодике можно использовать иммуноглобулины, с которыми белок А взаимодействует слабо (например, с мышиными иммуноглобулинами). Во-вторых, возможна прямая адсорбция антигена на полистирол, когда первичные антитела просто не используются. И, наконец, в качестве первич­ных антител можно применять не полные молекулы иммуноглобулинов, а молекулы, лишенные Fc-фрагментов, — так называемые Fab-фрагменты. В этом последнем случае дополнительным удобством методики будет являться то, что для конструирования диагностической системы можно будет использовать не две сыворотки» полученные от разных животных, а одну. Именно в связи с этими обстоятельствами в настоящее время разработано и разрабатывается большое число диагностических методик, использующих конъюгаты на основе белка А.