Постановка и учет результатов иммуноферментной реакции (ИФР)
Постановку и учет иммуноферментной реакции, в качестве примера, можно представить в микроварианте ИФР, разработанного Белозеровым С.Н., Успенским А.В., Ждановой О.Б. (1997), с целью обнаружения противотрихинеллезных антител в сыворотке крови животных (песцов). Нерастворимой основой служили планшеты из полистирола, при исследовании в ИФР небольшого количества проб использовали стрипы. Для разведения антигена использовали комплексирующий 0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6. Все виды биологических жидкостей (антиген, исследуемую сыворотку, конъюгат) и субстрат вносили в объеме 0,2 мл. Инкубировали антиген в течение часа, с последующим его инкубированием в холодильнике при +4 С в течение 16-20 часов. Планшеты отмывали от не связавшихся антигенов вначале водопроводной водой, потом 0,05% раствором Твина на водопроводной воде. Такую операцию проводили после каждого этапа постановки реакции.
Исследуемую сыворотку разводили 0,01 М фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7,2 с добавлением 0,05 % раствора Твина-40(20) и 0,05 % альбумина и вносили в лунки планшета в раститровке (для определения минимального диагностического титра), либо в скрининг - титре, определенном для тест системы, а затем инкубировали в течение 30 минут при температуре +37 С.
Отрицательным контролем служила сыворотка крови здорового животного, а положительным сыворотка здорового песца, экспериментально инвазированного 10000 личинок трихинелл на животное, взятая на 35 день с момента инвазии.
После отмывки от не связавшихся антител следующим этапом постановки ИФР было внесение конъюгата. Конъюгат вносили также в 0,01 М ФСБ рН 7,2 в рабочем разведении, испытанном предварительно для каждой серии конъюгата и инкубировали в течение 30 минут при температуре 37о С, после чего проводили отмывку от не связавшегося конъюгата. Каждое инкубирование проводили во влажной атмосфере. Рабочее разведение для данной серии конъюгата было установлено 1:3000.
Свежеприготовленную субстратную смесь (ортофенилендиамин в цитратном буфере) вносили в каждую лунку по 0,2 мл и выдерживали при комнатной температуре 30 минут в темноте. Реакцию останавливали, используя в качестве стоп-реагента концентрированную (0,9 моль/ л) серную кислоту, которую вносили в каждую лунку планшета по 50 мкл. Визуально оценку реакции проводили по интенсивности окрашивания лунок. Положительная реакция проявляется в виде потемнения субстратной смеси до красновато-бурого оттенка, в лунке сенсибилизированной антигеном, где инкубировалась сыворотка животного инвазированного Т. spiralis. При отсутствии изменения цвета реакцию оценивали как отрицательную. При незначительном изменении цвета субстратной смеси (при бледно-желтой окраске) реакцию оценивали, как сомнительную и сыворотку повторно исследовали в ИФР. Так как, при использовании ортофенилендиамина (ОФД) в качестве субстрата, окраска в случае положительной реакции имеет красноватый оттенок, то при учете реакции на спектрофотометре использовали длину волны 492 нм. Регистрацию результатов ИФА проводили немедленно после остановки пероксидазной активности на спектрофотометре.
Определение минимального специфического титра ИФР при трихинеллезе.
Минимальным специфическим титром считали такой, при котором наблюдали выявление пероксидазной активности по изменению цвета субстрата от насыщенного желтого до темно - бурого с сыворотками экспериментально инвазированнми личинками трихинелл песцов, но изменение цвета субстрата отсутствовало или было весьма незначительным (до бледно-лимонного) с гетерологическими (зараженных другими гельминтозами) сыворотками и сыворотками здоровых животных.