Методы консервации
Если исследование в день взятия материала невозможно (главным образом при массовых обследованиях), можно применять консерванты по Сафаралиеву или Берроузу.
1)Состав консерванта Сафаралиева: метиленовый синий - 0,2 г, 2% раствор сернокислого цинка - 82,5 мл, формалин концентрированный - 10 мл, уксусная кислота крепкая - 5 мл, фенол кристаллический - 2,5 г. Реактивы смешивают в указанном порядке. Фенол предварительно расплавляют на водяной бане. Консервант разливается во флакончики до половины их объема. Подлежащий исследованию материал от каждого больного немедленно эмульгируется отдельной деревянной палочкой в отдельном флакончике в количестве, составляющем примерно 1/3 объема консерванта. Простейшие окрашиваются уже через 5 - 10 мин и при необходимости могут сохраняться в течение нескольких месяцев. Для исследования каплю осадка со дна пробирки с помощью пипетки помещают на предметное стекло и покрывают покровным. Микроскопируют при увеличении 10Х60 или 10Х40. Иммерсионную систему используют в случае необходимости изучить объект более детально. Консервировать можно как оформленный кал, так и жидкие патологические субстраты. В смеси длительно сохраняются и хорошо окрашиваются не только цисты, но и вегетативные формы амеб и других простейших.
2)Консервант Берроуза имеет следующий состав: хлорид натрия - 0,7 г, формалин концентрированный - 5,0 мл, спирт этиловый 96о - 12,5 мл, фенол кристаллический - 2,0 г, вода дистиллированная - до 100 мл. Консервирование в нем производится таким же образом, как и в растворе Сафаралиева. Простейшие сохраняются в этом консерванте не дольше одного месяца. Для микроскопического исследования каплю осадка эмульгируют на предметном стекле в капле красящего раствора и покрывают покровным стеклом.В качестве красящего раствора используется 0,01% раствор тионина, азура или метиленового синего.
Метод обогащения. При скудном содержании простейших в кале они могут быть не обнаружены при микроскопировании нативных мазков и мазков с раствором Люголя. В этих случаях рекомендуется применить формалин-эфирное обогащение. Для этого кусочек кала величиной с горошину тщательно эмульгируют деревянной палочкой в центрифужной пробирке в 6 мл 10% раствора формалина на изотоническом растворе. В пробирку добавляют 2 мл эфира, закрывают резиновой пробкой, энергично встряхивают в течение 1 мин, а затем центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин или 1 мин при 2500 об/мин. После центрифугирования эмульсия разделяется на четыре слоя: окрашенный в желтый цвет верхний эфирный слой, слой фекалий (фекальная пробка), затем слой формалина и под ним осадок, в котором содержатся цисты простейших. Деревянной палочкой (отдельной для каждой пробы) слой фекалий отделяют от стенок пробирки и все содержимое ее, за исключением осадка, сливают. Наклонив пробирку отверстием книзу, быстро протирают ее стенки ватным или марлевым тампоном, стараясь удалить возможно большее количество жидкости, но не затрагивая осадок. Переворачивают пробирку отверстием вверх, переносят отдельной пипеткой осадок на предметное стекло, эмульгируют его в капле раствора Люголя и исследуют по обычной методике. В случае необходимости приготовленную эмульсию можно хранить в закрытой резиновой пробкой пробирке до 2 сут.
В процессе приготовления центрифугата даже некоторые цисты простейших частично подвергаются деструкции. Вегетативные же их формы при этом совершенно разрушаются. Поэтому указанный метод непригоден для обнаружения трихомонад и диэнтамеб, которые не образуют цист, а также для исследования жидкого стула, в котором цисты отсутствуют.
Метод приготовления постоянных препаратов, окрашенных по Гейденгайну. Иногда в нативных мазках или в мазках с раствором йода точно определить вид простейшего не удается. Постоянные препараты, окрашенные по Гейденгайну, благодаря выявлению тонких структурных особенностей, позволяют распознавать простейших как по вегетативным формам, так и по цистам. Для изготовления препаратов пригоден материал любой консистенции. Обычно готовят не менее двух препаратов. Фиксация:
- Концом деревянной палочки исследуемый кал тонким слоем быстро наносится на предметное или покровное стекло (следить, чтобы материал не подсох). Мазок погружают в фиксирующую жидкость Шаудина, налитую в чашку Петри. Жидкость состоит из 2 частей насыщенного раствора сулемы (8,5: 100; растворять при нагревании) и одной части 96о спирта-ректификата, к которым добавляется ледяная уксусная кислота (3-5% к общему объему жидкости). Мазки фиксируются 15 - 20 минут.
- Мазки переносятся в 70 о спирт на 5 мин.
- Для окончательного удаления сулемы препараты помещаются на 5 - 10 минут в спирт-йод (в 70о спирт добавляется несколько капель настойки йода до светло-коричневого цвета ). Для удаления иода препараты выдерживаются в 70о спирте 5 мин. Если окраска не может быть произведена сразу, то их можно сохранять в спирте несколько дней. Протрава и окраска:
- Перед окраской - промывка дистиллированной водой - 3 мин.
- Протрава в 2 - 3% водном растворе железо-аммиачных квасцов в течение 4-20 часов (в зависимости от температуры).Кристаллы квасцов должны быть слабо фиолетового цвета; желтые не пригодны.
- Быстрое (1-3 сек.) споласкивание в дистиллированной воде.
- Перенос для окраски в 0,5% раствор гематоксилина. Для его приготовления 1,0 г кристаллическюго гематоксилина растворяют в 10 см3 96о спирта, добавляют 90 см3 дистиллированной воды и выдерживают 10 - 20 дней. За 4-24 часа перед употреблением разводят наполовину дистиллированной водой.
- Промывка перекрашенного препарата водой в течение 10 - 20 мин.
Дифференцирование:
- Для извлечения избытка краски препарат помещают в 0,5 - 1% раствор железо-аммиачных квасцов и следят за обесцвечиванием до появления серо-лилового фоа окраски препарата. На этом дифференцировку заканчивают, не доводя обесцвечивание до коричневого и желтого фона, что указывает на излишнее удаление краски, вследствие чего препараты становятся негоднmыми. Промывка в водопроводной воде (лучше проточной) 2О - 40 мин.
Обезвоживание, просветление и заделка препарата:
- Помещение препарата последовательно в 70о, 85 о и 96 о спирты, на 2 - 3 мин в каждый.
- Перенос в карбол-ксилол (25 грамм кристаллической карболовой кислоты растворить в 75 куб. см. ксилола) на 2 мин.
- Выдержать в чистом ксилоле 1 мин.
- На препарат поместить каплю канадского бальзама и накрыть покровным стеклом. Если при заделке в канадский бальзам появляется муть, значит обезвоживание было недостаточно и его надо повторить, заменив карбол-ксилол свежим.
Постоянные препараты, изготовленные таким методом, сохраняются без изменений годами. Он позволяет проводить совершенно точную диагностику простейших и дифференцйровать их от различных псевдопротозойных образований, часто наблюдаемых в кале, которые при недостаточном опыте могут быть приняты за вегетативные формы или цисты простейших.