Методы генного зондирования
Интенсивное развитие молекулярной биологии и создание совершенной методической базы генетических исследований явились основой генетической инженерии. В области диагностики возникло и бурно развивается направление по определению специфических нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК, зонд с меткой так называемое генное зондирование. В основе подобных методик лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации—образованию двухцепочных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов (А-Т, Г-Ц). Для (или РНК) специально создается, так называемый, зонд-полинуклеотид с определенной последовательностью оснрований. В его состав вводят специальную метку позволяющую идентифицировать образование комплекса. Хотя генное зондирование нельзя отнести к методам иммунохимического анализа, основной его принцип (взаимодействие комплементарных структур) методически реализуется теми же способами, что и индикаторные методы иммунодиагностики. Кроме того, методы генного зондирования позволяют восполнить информацию об инфекционном агенте в отсутствии его фенотипической экспрессии. Первые сообщения об использовании зондов были связаны с чисто исследовательскими задачами молекулярной биологии — контролем наличия тех или иных последовательностей ДНК в общем пуле клеточной ДНК. Различают несколько разновидностей генного зондирования: гибридизация по Саузерну (анализ ДНК), Nothern-blot (анализ РНК), точечная гибридизация, гибридизация in situ (на срезе, в мазке).
Для проведения анализа ДНК пробу подвергают денатурации с целью получения одноцепочных структур, с которыми и реагируют молекулы ДНК- или РНК-зонда. Для приготовления зондов используют либо различные участки ДНК (или РНК), выделенные из естественного источника (например, того или иного патогенного организма), как правило представленные в виде генетических последовательностей в составе векторных плазмид, либо химически синтезированные олигонуклеотиды. В некоторых случаях в качестве зонда применяют препараты геномной ДНК, гидролизованной на фрагменты, иногда — препараты РНК, особенно часто — рибосомальная РНК (Stull Т. et al., 1988).
В качестве метки используют те же индикаторы, что и при различных видах иммунохимического анализа: радиоактивные изотопы, флуоресцеины, биотин (с дальнейшим проявлением комплексом авидин-фермент) и т. п.
Порядок проведения анализа определяется свойствами имеющегося зонда. В исследовательских лабораториях используют ДНК-зонды, приготовленные самостоятельно и меченые, как правило, радиоактивным фосфором. В настоящее время все чаще применяются коммерческие наборы, содержащие все необходимые ингредиенты.
В большинстве случаев процедуру проведения анализа можно разделить на следующие стадии: подготовка образцов (в том числе экстракция и денатурация ДНК), фиксация пробы на носителе (чаще всего — полимерный мембранный фильтр), предгибридизация, собственно гибридизация, отмывание несвязавшихся продуктов, детекция. При отсутствии стандартного препарата ДНК- или РНК-зонда предварительно проводится его получение и введение метки.
Проводится и непосредственный анализ образцов сыворотки крови, мочи, уретральных соскобов, форменных элементов крови или цельной крови на присутствие инфекционного агента. Для освобождения нуклеиновых кислот из состава клеточных структур проводят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают препарат ДНК с помощью фенола. Денатурация ДНК, т. е. переход ее в одноцепочную форму, происходит при обработке щелочью. Затем образец нуклеиновых кислот фиксируют на носителе — нитроцеллюлезной или нейлоновой мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 час при 80 С в вакууме. Далее, в процессе предгибридизации достигается инактивация свободных мест связывания для уменьшения неспецифического взаимодействия зонда с мембраной. Процесс гибридизации занимает от 2 до 20 ч, в зависимости от концентрации ДНК в образце, концентрации используемого зонда и его размера.
После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов проводится детекция образовавшегося комплекса. Если в состав зонда входит радиоактивная метка, то для проявления реакции мембрану экспонируют с фотопленкой (ауторадиография). Для других меток используют соответствующие процедуры. Например, известен метод определения модифицированных участков ДНК с помощью антител (Stollar В., Rashtchian A., 1987), введением в состав зонда низкомолекулярных компонентов (биотин, дигоксин и т. п.) с последующим проявлением конъюгатом авидин-фермент, антитело-фермент (van Brunt J., Klausner A., 1987).
Первые сообщения о коммерческих образцах наборов для генного зондирования появились в 1986 г. — ими стали наборы для определения М. pneumoniae, L. pneumoniae. Затем появились наборы для индентификации других патогенов.
Наиболее перспективным является получение нерадиоактивных (так называемых — холодных) зондов. На этой же основе развивается методика гибридизации, позволяющая устанавливать наличие патогена в препаратах срезов, пунктатов ткани, что особенно важно при патоморфологическом анализе (гибридизация in situ).
Существенным этапом в развитии методов генного зондирования явилось использование полимеразной реакции амплификации (PCR). Этот подход позволяет увеличить концентрацию определенной (заранее известной) последовательности ДНК в пробе за счет синтеза многочисленных копий in vitro. Для проведения реакции к исследуемому образцу ДНК добавляют препарат фермента ДНК-полимеразы, избыток дезоксинуклеотидов для синтеза и, так называемые, праймеры — два типа олигонуклеотидов величиной 20—25 оснований, соответствующих концевым участкам интересующей последовательности ДНК. Один из праймеров должен быть копией начала участка считывания кодирующей цепи ДНК при направлении считывания 5—3, а второй — копией противоположного конца некодирующей цепи. Тогда при каждом цикле полимеразной реакции происходит удвоение количества ДНК-копий.
Для осуществления связывания праймеров необходима денатурация ДНК (плавление) при 94°С с последующим доведением смеси до 40—55°С. В первом сообщении, описывающем метод, полимеразу добавляли вновь после каждого взаимодействия праймеров с ДНК, так как фермент не выдерживал нагревания до 94°С. В настоящее время чаще используют ДНК- полимеразу термофильной бактерии Т. aquaticus, выдерживающую такую температуру и имеющую максимум активности при 70°С.
Для проведения реакции сконструированы программируемые инкубаторы микропроб, позволяющие легко чередовать изменения температуры, оптимальной для каждого этапа реакции.
Методы, связанные с использованием генного зондирования безусловно, будут более широко внедряться в практику диагностики паразитарных заболеваний по мере их упрощения и удешевления.